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Die Polymerase-Kettenreaktion

von Magnus Manske

Polymerase Chain Reaction (PCR) is a method for amplifying (creating multiple copies of) DNA without using a living organism, for example, E. coli or yeast. Kary Mullis invented the PCR process in the early 1980s and was later awarded the Nobel Prize in Chemistry for his work. In 1989, Hoffman La Roche and Perkin-Elmer Corporation patented this process. PCR is commonly used in medical and biological research labs for a variety of tasks, such as the detection of hereditary diseases, the identification of genetic fingerprints, the building of DNA-based phylogenetic trees (trees of species relations), the cloning of genes (see below), and paternity testing.

Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode, um DNS zu vervielfältigen ohne lebende Organismen, wie z.B. E. coli oder Hefe zu verwenden. Sie wurde Anfang der 1980iger Jahre von Kary Mullis erfunden, wofür er den Chemie-Nobelpreis erhielt. 1989 ließen Hoffman La Roche und die Perkin-Elmer Corporation die PCR-Methode patentieren. PCR wird gewöhnlich in medizinischen und biologischen Forschungslaboren für eine Vielzahl von Aufgaben eingesetzt, unter anderem zur Erkennung von Erbkrankheiten, zur Identifikation genetischer Fingerabdrücke, zur Erzeugung von genetischen Stammbäumen, zur Klonierung von Genen (siehe unten) und für Vaterschaftstests.

PCR can start with a very small amount of template DNA (original DNA)--at times, with just one strand. During the PCR process, the given DNA is copied by an enzyme called DNA-Polymerase, which duplicates a DNA strand. Usually, only a small part of the DNA strand is copied using PCR. This part is selected by primers, short artificial DNA strands (20-40 base pairs), <note>DNA is double-stranded, and therefore, it is measured in complementary DNA building blocks called base pairs.</note> which exactly match each end of the part to be copied.

PCR benötigt sehr wenig Ausgangsmaterial, in manchen Fällen genügt ein einziger DNS-Strang. Während der Kettenreaktion wird die DNS durch das Enzym DNS-Polymerase kopiert. Normalerweise wird nur ein kleiner Teil eines langen DNS-Strangs durch PCR verdoppelt. Dieser Teil wird durch die Primer, kurze, künstliche DNS-Stücke (20-40 Basenpaare), <note> DNS besteht aus einem Doppelstrang, daher wird ihre Länge in komplementären Einheiten, den Basenpaaren, gemessen</note> festgelegt, welche genau mit dem Anfang bzw. dem Ende des zu kopierenden Strangs übereinstimmen.

The PCR machine is basically a computer-controlled oven, where a program controls the timing and the temperature. The PCR process consists of several iterations, usually 15-30, and each iteration consists of the following steps (see Figure 1):

Die PCR-Maschine besteht aus einem computerkontrollierten Ofen, bei dem ein Programm Zeit und Temperatur steuert. Der PCR-Prozess besteht aus mehreren (normalerweise 15-30) Wiederholungen der drei folgenden Schritte (siehe Abbildung 1):

1. Melting (96°C, 30-600 seconds). In the melting step, the double-stranded DNA is divided into two single strands, like opening a zipper. In the current practice of PCR (April 2001), the DNA-Polymerase is thermostable (stable at high temperatures). Since the DNA-Polymerase is currently derived from bacteria in geysers, it is not inactivated by the melting step.

1. Melting (Schmelzen, 96°C, 30-600 Sekunden). Im Melting-Schritt wird die doppelsträngige DNS wie ein Reißverschluss in ihre beiden Einzelstränge aufgetrennt. Derzeit (April 2001) üblich ist eine thermostabile (d.h., bei hohen Temperaturen stabile) DNS-Polymerase. Diese DNS-Polymerase, die aus Bakterien aus heißen Quellen gewonnen wird, wird durch den Melting-Schritt nicht deaktiviert.

2. Annealing (65-80°C, 30-120 seconds). In the annealing step, the primers anneal (attach themselves) to the single DNA strands. The DNA-Polymerase then binds to each annealed primer.

2. Annealing (Anlagerung, 65-80°C, 30-120 Sekunden). Im Annealing-Schritt lagern sich die Primer an die einzelnen DNS-Stränge an. Anschließend lagert sich die DNS-Polymerase an die angelagerten Primer an.

3. Elongation (65-80°C, 30-120 seconds). In the elongation step, the DNA-Polymerase runs along the single DNA strand, creating the missing second DNA strand in the process.

3. Elongation (Verlängerung, 65-80°C, 30-120 Sekunden). Im Elongation-Schritt läuft die DNS-Polymerase an der einzelsträngigen DNS entlang, wobei sie den fehlenden zweiten Strang erzeugt.

After each iteration, the amount of DNA is doubled. Therefore, after multiple iterations, the amount of DNA has increased by powers of 2. For example, after 30 iterations one DNA strand has been copied into 230 = 1 073 741 824 strands that are exact copies of the part of the first strand that was chosen by the primers.

Bei jedem Durchlauf der drei Schritte wird die DNS verdoppelt, die DNS-Menge steigt also expotential (mit Basis 2) an. So werden beispielsweise in 30 Durchläufen von einem DNS-Strang 230 = 1 073 741 824 exakte Kopien von dem durch die Primer bestimmten Teil angefertigt.

Figure 1: Schematic drawing of the PCR cycle. <note>The 3's and 5's mark the orientation of the DNA strands. Many enzymes run only in one direction along a DNA strand, for example, DNA-Polymerase runs in the direction of the 3' end.</note> (Figure by author.) (1) Melting at 96°C. (2) Annealing at 68°C. (3) Elongation at 72°C (P=Polymerase). (4) The first cycle is complete. The two resulting DNA strands make up the template DNA for the next cycle, thus doubling the amount of DNA duplicated for each new cycle.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des PCR-Zyklus. <note> Die 3'- und 5'-Markierungen zeigen die Ausrichtung der DNS-Stränge. Viele Enzyme laufen nur in eine Richtung entlang eines DNS-Strangs, die DNS-Polymerase zum Beispiel nur in Richtung des 3'-Endes.</note> (1) Schmelzen bei 96°C. (2) Anlagerung bei 68°C. (3) Verlängerung bei 72°C (P=Polymerase). (4) Der erste Zyklus ist komplett. Die beiden erzeugten DNS-Stränge werden zum Ausgangsmaterial für den nächsten Zyklus, wodurch sich die Menge an DNS bei jedem Zyklus verdoppelt.

With PCR it has become possible to clone a gene, just one gene or even just a part of a gene. This process should not be confused with the cloning of a whole organism. Cloning a gene involves, first, the separating of a single gene from one organism, and then the inserting of the gene into another organism, like a bacterium. As a result, the cloned gene can then be studied in detail in the new organism. PCR is often used in this process to isolate a single gene through amplification, before it is transferred to the new organism. PCR is also used to introduce mutations (changes) into strands of DNA. Through PCR mutation, then, a gene can be mutated to study the effects of such a change. PCR is a useful tool in biotechnology, too--for example, in altering bacteria to produce medicine.

Durch PCR wurde es möglich, ein einzelnes Gen, oder auch nur einen Teil davon zu klonieren. Das sollte nicht mit dem Klonen ganzer Lebewesen verwechselt werden. Für die Klonierung eines Gens muss es zuerst aus einem Organismus entnommen und dann in einen anderen, z.B. ein Bakterium, eingebaut werden. Dann kann das klonierte Gen im neuen Organismus detailliert untersucht werden. PCR wird häufig verwendet, um das Gen aus dem ersten Organismus durch Vervielfältigung zu isolieren, bevor es in den zweiten transferiert wird. PCR wird auch benutzt, um gezielt Mutationen (Veränderungen) in DNS-Stängen hervorzurufen. Ein derart verändertes Gen kann dann auf die Auswirkungen der Veränderung hin untersucht werden. Auch in der Biotechnologie wird PCR häufig verwendet, z.B. um Bakterien so zu verändern, dass sie Arznei herstellen.